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发布时间:2021-06-03

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DMF备案全能核酸酶,为生物制品解决核酸残留困扰

随着越来越多的生物制品(重组蛋白、Vero细胞疫苗等)进入治疗领域,生物制品的质量控制也日趋严格,其中核酸残留是各类质控标准的重中之重,因为DNA较好的稳定性,容易在生产过程中形成残留,而这些生物制品应用到人类疾病预防和治疗时,会带来不可控危险因素。终产品的宿主核酸残留量必须遵循WHOFDAEMEA以及我国NMPA监管条例。尤其近年来包括大牌进口产品在内的狂犬疫苗DNA残留超标问题,引起了社会和业界的广泛关注。



生物制品核酸残留的风险

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生产生物制品的宿主细胞多是连续传代细胞(CCLs),因其调控生长的基因失灵,而拥有无限增殖的能力。CCLs的残留DNA可能使人体细胞增殖失控,变成肿瘤细胞。


此外,残留DNA中可能存在感染性病毒基因组,病毒基因组能够扩增并产生感染性病毒粒子。体外实验表明,1pg逆转录病毒的前病毒DNA就具有感染性。有些残留DNA可能携带HIV病毒或者Ras致癌基因,DNA感染性风险可能比致瘤风险更高。


另外,有学者认为,接种几十针疫苗后,其残留的DNA累积可能具有其他潜在危害:未发生降解的外源DNA,在哺乳细胞基因LINE-1的逆转录转座子作用下有插入细胞基因组的可能性,带来其他潜在风险。


而且,由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列,增加了重组蛋白药物在体内的免疫原性风险,可能增加体内免疫反应,诱导产生DNA抗体。


所以需要严格控制生物制品的残留DNA,避免上述种种风险危害。



WHO和各国药物监管机构一般控制100pg/剂量的残留DNA,特殊情况下最高允许10ng/剂量。我国参照WHOFDA和欧盟标准,在药典中对生物制品的核酸残留量有明确规定。药典中明确规定酵母、大肠杆菌表达的生物制品中DNA残留量不超过10ng/剂量,CHOVero细胞表达的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超过10010pg/剂量;残留DNA长度小于200bp


生物制品的核酸残留去除主要集中在病毒疫苗生产、重组蛋白药物纯化、细胞治疗和疫苗研究中缓解PBMC细胞结团以及慢病毒的大规模纯化等。


在一般的情况下,含氯消毒液、紫外灯照射等能够消除环境或产品表面的核酸,但是对于生物制品在生产过程中产生的核酸,则需要更具针对性的核酸去除剂,现在大多选择核酸酶进行去除。核酸酶能够消除核酸残留的潜在危害,降低样品粘度,提高产品纯化效率。


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BenzoNuclease 是一种来自于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),经基因工程改造的核酸内切酶。BenzoNuclease可降解单链、双链、线性、环状、超螺旋等任何形式的DNARNA,将核酸完全降解成3~5个碱基长度的5'-单磷酸寡核苷酸。因其能高效降解任何形式的 DNA RNA,又被称为“全能核酸酶”。


无论在实验室研究还是在工业级生产的过程中,BenzoNuclease是去除生物制品中所有形式DNARNA的一种有效工具酶。通过高效的核酸去除,可显著提升后续实验、生产的效果及产量,性能优于其他核酸去除方法。 


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  • 去除疫苗类产品外源性核酸,降低核酸残留毒性风险,提高产品安全性

  • 降低细胞/细菌裂解时核酸释放产生的黏度,缩短处理时间,提高病毒/蛋白产量

  • 去除缠绕在颗粒(病毒、包涵体等)表面的核酸,利于颗粒的释放和纯化

  • ELISA、柱层析、二维电泳和印迹分析的样品制备,经核酸酶处理后可提高分辨率和回收率

  • 用于预防细胞的结团

  • ……


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1、保存稳定性以及冻融稳定性



2、消化不同类型核酸




3、钠离子、钾离子的影响



4、Triton® X-100的影响



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1. 在哪一步中加入 BenzoNuclease

BenzoNuclease可直接加入至细胞/细菌裂解液中进行作用。注意,若裂解液中不含Mg2+,需补加Mg2+1-2mM

入样本中。


2. 当反应温度低于 37℃时,如何保证 BenzoNuclease 的消化效果?

在体系固定的情况下,BenzoNuclease 的消化效果主要取决于酶用量、反应温度以及反应时间,当反应温度较低时,为避免过多的 BenzoNuclease 引起的残留问题,更加推荐延长反应时间来保证 BenzoNuclease 的消化效果。


3. BenzoNuclease 的抑制条件有哪些?

BenzoNuclease 可在较为宽泛的条件下保持活性,但 1-2mMMg2+对其活性至关重要。

一般情况下,BenzoNuclease 的活性可被高盐抑制,例如:> 500 mM 的一价阳离子(如 Na+、K+等)、>100 mM 的盐酸胍(guanidine HCl)、> 100 mM 的磷酸盐(phosphate)、> 100 mM 的硫酸铵(ammonium sulfate)等。此外,螯合剂也可通过螯合体系中的 Mg2+以达到抑制酶活的作用,通过加入更多的 Mg2+可恢复 BenzoNuclease 的活性(1mMEDTA 可部分抑制 BenzoNuclease 活性,5mMEDTA 可使其活性丧失约 90%


4. BenzoNuclease 与蛋白酶抑制剂可以兼容吗?

可以。但需要注意,最好选择不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂(≥1mMEDTA 可抑制 BenzoNucleased 的活性)。


5. 如何去除 BenzoNuclease

BenzoNuclease 融合了 6×His 标签,可通过镍柱将其去除。此外,也可结合所生产产品本身的纯化工艺对BenzoNuclease进行去除,如通过 TFF(tangential flow filtration)、透析及色谱(IEX, SEC, HIC)、超滤等。


6. BenzoNuclease的应用是否有专利限制?

无专利限制。


7. 料液经过BenzoNuclease处理后的核酸残留使用什么方法检测比较好?

推荐使用qPCR进行检测,qPCR方法的灵敏度和重复性较好,并且可定量,可以对核酸残留有更加准确的把握。


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