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发布时间:2021-06-03

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新冠突变株假病毒/蛋白助力抗疫

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病毒已经多次变异,那我们现在研究的疫苗和治疗药物还有用吗?

因此有必要对新的病毒突变型进行研究。


51日,剑桥大学的Gupta组评估了印度突变株B.1.617的逃逸情况。B.1.617具有E484QL452“双突变”,相比野生型,E484Q突变使疫苗接种血清中和活性下降了6倍,而L452使血清中和活性下降了4倍。但E484Q比南非突变株中E484K突变对疫苗接种血清中和活性降低的幅度要小。


有意思的是,疫苗接种者的血清对具有E484QL452“双突变”的中和活性也下降了4倍,和仅含L452单一突变的假病毒的中和活性相当。所以“双突变”对于疫苗接种的血清的逃逸并没有增加。这说明加大疫苗接种可能可以遏制这一突变株流行。


NEJM近期接连公布了两款疫苗对南非变异株B.1.351的效果,分别是ChAdOx1 nCoV-19(牛津-AZ,腺病毒载体疫苗,上市)和NVX-CoV2373(Novavax-CEPI,重组蛋白疫苗,IIa-b期临床)。


结果显示,ChAdOx1 nCoV-19对南非变异株轻度到中度症状感染无有效防护,而它是否具备足够对南非变异株重症感染的保护效力,需要进一步的研究确认。NVX-CoV2373对有症状新冠感染的有效保护力有所下降。


由于新冠病毒具有很强的感染性和致病性,使用新冠活病毒进行验证必须在生物安全三级以上实验室进行,受实验室条件和病毒来源的限制。另外,由于病毒株、培养条件以及对结果的评估标准不同,不同实验室的活病毒检测结果常存在一些差异。从安全性以及可操作性,使用假病毒更方便。假病毒是病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的异源核酸形成的类似于真病毒的具有感染性的病毒颗粒,由于被包裹的核酸不具有复制形成病毒的全部核酸序列的能力,所以假病毒只有一轮感染力,操作安全。另外,假病毒具备和真病毒一样的感染性,进入细胞的过程和真病毒一样,但其进入细胞后不具有复制产生病毒的能力,因而没有危害。且假病毒易于实现标准化,利于评估临床前及临床阶段的疫苗的抗病毒效果。


近岸蛋白质开发的新冠相关假病毒是使用 293T 包装而成的 SARS-CoV-2 (2019-nCoV)假病毒,病毒表面表达 S 突发蛋白,RNA 核心为GFPLuciferase标记,GFP绿色荧光观察更直观、Luciferase同时满足灵敏度和定量要求。本病毒可以特异性侵染 ACE2 表达的细胞,病毒感染成功后细胞即表达GFP或者Luciferase


XCV03:新冠假病毒;XCC14:过表达ACE2的细胞

1 假病毒侵染HEK293THEK293T-ACE2荧光图片 (来源:www.novoprotein.com.cn


XCV03:新冠假病毒;XCC14:过表达ACE2的细胞

2 假病毒侵染HEK293THEK293T-ACE2测定luciferase数值 (来源:www.novoprotein.com.cn


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疫苗本身的效价需要进行评估,另因疫苗本身的限制,并不能百分之百保护接种者(临床保护数据:Moderna mRNA疫苗 94.5%,BioNtech mRNA疫苗 95%,阿斯利康 腺病毒疫苗 62-90%),对于疫苗接种后的保护效力,都有必要进行评估。


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作为有抗病毒活性的中和抗体,它仅占B细胞分泌的抗体中少部分,中和抗体的血液滴度至关重要,评估新冠疫苗有效性的最重要的一项指标就是受试者体内中和抗体的含量。中和抗体保护机体的原理:结合新冠病毒表面蛋白,并阻断病毒蛋白与细胞表面特异性受体ACE-2结合,进而阻止病毒入侵细胞(非中和抗体无此功能)。中和抗体滴度不足时,可能会导致抗体依赖增强(ADE,Antibody-dependent enhancement)疾病恶化:病毒通过抗体与细胞表面的Fc受体结合,进而感染包括巨噬细胞在内的更多种类细胞,导致免疫应答紊乱,干扰各种细胞因子信号,导致巨噬细胞在中后期负担过重,出现活化异常,炎症因子分泌增加,最终造成急性炎症和机体病理损伤。


ADE:不理想的抗体导致冠状病毒感染加剧的两种方式。绿色代表抗体,黄色代表细胞,细胞表面突起的蓝色为Fc受体。(来源:DOI: 10.1038/s41577-020-0321-6


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中和抗体可阻止病毒侵染细胞,在病毒感染细胞系统中加入中和抗体(注射疫苗后的血清/中和抗体阳性对照),检测被侵染细胞减少情况,计算其阻断效果。


中和抗体抑制新冠假病毒侵染细胞(来源:www.novoprotein.com.cn


假病毒检测系统:新冠假病毒(Novoprotein Cat.XCV03)无自我复制能力,其表面表达S全长蛋白,内含绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luciferase)报告基因,可以特异性侵染表达ACE-2的细胞(Novoprotein Cat.XCC14)。被病毒侵染后的细胞即表达GFPLuciferase,发出荧光,从而可以便捷观察结果,并通过化学发光酶标仪检测,实现定量分析。如果受试者接种疫苗后产生中和抗体滴度高,会结合新冠表面蛋白阻断病毒蛋白与细胞表面特异性受体ACE2的结合,进而阻止病毒入侵细胞,这样就不会发出荧光。具体操作方法可以用荧光倒置显微镜观察荧光或者用化学发光酶标仪检测荧光素酶的表达,这里就不一一赘述了。简而言之,可以用假病毒侵染验证实验来评估接种疫苗后中和抗体的水平。


另外评估新冠疫苗效价的其他方法如免疫阻断验证法以及T细胞免疫应答评估,如果大家感兴趣可以阅读我们公众号中新冠疫苗效价评估这篇文章,在这里就不做详细介绍了。


总而言之,我们开发的假病毒检测系统检测精度和重复性好,内含荧光报告基因利于定量和标准化,且无自我复制能力,只侵染表达ACE-2细胞,很安全,助力于各个领域的研究者进行研究。目前近岸蛋白质提供的假病毒和新冠病毒突变体蛋白相关产品,详见下方列表。


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