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发布时间:2021-02-10

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肿瘤治疗方法新突破——无干扰基因-药物联合治疗法

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为了评价CENP联合治疗的疗效,该研究以编码CRISPRi系统的质粒DNADOX作为基因和药物的模型组合。研究者利用羧基杯[4](CAC4A)设计组装了嵌入式杯芳烃纳米颗粒(CENP),如下图1:混合分子药物阿霉素(DOX)CAC4A,形成复合物;2:复合物与dCas9-miR-21质粒DNA通过苯硼酸修饰的聚乙烯亚胺(PEI-PBA)混合,形成嵌入式杯芳烃聚合物核心(CEPC-DOX);3:用顺式丙酮酸酐修饰的聚乙二醇-b-聚赖氨酸制成的聚合物外壳包裹CEPC-DOX,得到CENP-DOX。生理环境下,CENP-DOX因为有聚乙二醇外壳,并带有负电荷,可以避免机体免疫清除和在正常组织中的累积,当进入肿瘤酸性微环境时,CA基团的分解诱导聚合物外壳的快速分离和阳离子性CEPC-DOX的释放,从而增强了CEPN-DOX在肿瘤中的积累和细胞内化。


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荧光滴定法结果显示CAC4APBS中与分子药物DOX、DNR、CPT、CPT-11的高度亲和力。同时紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和等温滴定量热法(ITC)结果显示,随着pDNA的加入,DOX、DNR、CPT、CPT、CPT-11的紫外吸收度或荧光强度明显下降,提示分子药物与治疗基因之间确实存在了互相干扰。


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然而,当pDNACAC4A-DOX、CAC4A-DNR、CAC4A-CPT、CAC4A-CPT-11复合物混合后,紫外吸收光仅有极微弱的变化,表明CAC4A的引入使分子药物与pDNA之间的相互干扰作用变弱。随后等温滴定量热法的相关实验也证明了CAC4A可以通过将客体分子结合到pDNA的空腔中来分离客体分子与pDNA的相互作用。


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最后研究人员把DOX被作为代表性分子药物用于后续的细胞和动物研究。


CENP-DOX包含TOTO-3标记的pDNA,在不同条件下与U87MG细胞培养4小时。结果显示,pDNA和分子药物能够在酸性和缺氧条件下培养(缺氧/pH 6.8)实现有效的细胞内化。


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为了评估CENP在细胞内递送CRISPRi系统用于癌症治疗的能力,研究了三种编码dCas9pDNAs和靶向miR-21启动子和编码区不同位置的sgRNA,命名为dCas9-miR-21#1, dCas9-miR-21#2, and dCas9-miR-21#3。转染细胞培养48小时后,qPCR验证CRISPRi系统的干扰效率。结果显示dCas9-miR-21#2miR-21表达的抑制效率最高(72.1%)


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然后将U87MGMDA-MB-231细胞与含有dCas9-miR-21#2CENP孵育,标记为CENP/dCas9-miR-21。结果显示,在pH6.8时,CENP/dCas9- miR-21U87MGMDA-MB-231细胞中miR-21的表达均显著下调,表明在酸性环境下其有效激活CENP/dCas9-miR-21CRISPRi系统,从而避免了对正常组织潜在的不利影响。


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在随后的荷瘤小鼠实验中也验证了分子药物和治疗基因的联合治疗效果。CENP/dCas9-miR-21处理小鼠的肿瘤生长速度明显受到抑制。同时,CENP/dCas9-miR-21处理的小鼠没有明显的体重下降,证明其有良好的生物相容性。


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当然该研究中的工作不止以上几点,还有大量的工作用于验证诸如肿瘤血管生长相关的基因表达情况和生化病理检查验证该方法的安全性等,本文将不再做详细解析,感兴趣的读者可以再去研究该论文。


这项研究的重要意义之处在于,研究者开发了一种嵌入式杯芳烃纳米颗粒(CENP)可以在不损害分子药物和治疗基因生物学功能的前提下,共同传递分子药物和治疗基因,从而实现无干扰的基因-药物联合治疗癌症。其优势在于克服了传统的长期化疗方式引起的肿瘤耐药性和基因治疗与分子药物联合治疗时的相互干扰问题,为发展无干扰的基因-药物联合肿瘤治疗提供了一个通用的平台。


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