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发布时间:2021-02-10

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高福院士联合康华生物发表首个RBD二聚体AdC7腺病毒疫苗动物实验结果:可高效诱导中和抗体应答


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在前所未有的COVID-19大流行中,为了更好的防控迫切需要一种安全有效的疫苗。目前有四种表达spike (S)蛋白的腺病毒载体疫苗已进入临床III期试验,其中三种已获批使用。202129日,高福,戴连攀等人在BioRxiv上在线发表题为“Recombinant chimpanzee adenovirus AdC7 expressing dimeric tandem-repeat RBD of SARS-CoV-2 spike protein protects mice against COVID-19”的研究论文,该研究分别构建了表达S、RBD和串联重复的RBD二聚体(RBD-tr2)的重组黑猩猩腺病毒载体(AdC7)疫苗。该研究发现,无论通过肌肉还是鼻内接种的疫苗在小鼠体内都具有很强的免疫原性,可引起体液和细胞(Th1)免疫应答。与AdC7-SAdC7-RBD相比,AdC7-RBD-tr2具有更高的抗体应答。鼻内接种AdC7-RBD-tr2还可在支气管肺泡灌洗液(BALF)中诱导具有中和活性的黏膜免疫。单剂量或两剂量的AdC7-RBD-tr2黏膜给药可以保护小鼠抵抗SARS-CoV-2攻击,并在肺中检测不到亚基因组RNA,从而减轻了肺损伤。以上结果均显示AdC7-RBD-tr2可作为一种有希望的COVID-19候选疫苗。


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S蛋白包含S1S2两个亚基,S1RBD区域可以识别宿主细胞受体ACE-2S2的作用是使病毒和宿主细胞膜融合。因此,S蛋白是COVID-19疫苗研发的主要目标。强大的中和抗体主要针对S蛋白RBD,以阻断受体结合,因此RBD也是有吸引力的疫苗目标。本研究者构建了三种分别表达SARS-CoV-2全长S、RBDRBD-tr2AdC7疫苗进行评估。


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1. S、RBDRBD-tr2的结构示意图


为了评估重组AdC7-S、AdC7-RBDAdC7-RBD-tr2疫苗的免疫原性,在第0天和第28天通过肌肉(i.m.)注射1x 1011vp AdC7免疫小鼠,没有转入任何SARS-CoV-2基因的AdC7作为对照,在第2142天收集血液样本检测结合RBDIgGIgA的滴度(图2.B)。结果显示,AdC7-S、AdC7-RBDAdC7-RBD-tr2均可有效诱导特异性结合RBDIgG(图2.C),而只有接种AdC7-RBD-tr2的小鼠可中度诱导特异性结合RBDIgA抗体(图3.A)。由于中和抗体在保护中起着至关重要的作用,因此使用SARS-CoV-2 S蛋白的假病毒来检测免疫小鼠血清中的中和抗体效价。结果显示,每种AdC7疫苗加强免疫后,小鼠血清的90%中和效价(NT90)均有所提高。两次剂量的AdC7-S、AdC7-RBDAdC7-RBD-tr2分别诱导NT90平均滴度为52、72416。与其他构建体相比,AdC7-RBD-tr2表现出明显更高的中和效价(图2.D)。


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3. AdC7疫苗i.m.i.n.免疫BALB/c小鼠的体液免疫应答特征


SARS-CoV-2通过呼吸道飞沫传播,引起肺部损伤性疾病。呼吸道和肺部的特异性免疫应答可对SARS-CoV-2原位感染产生保护作用。免疫小鼠实施安乐死并收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。对于BALF,检测了与RBD结合的IgG,IgA和假病毒NT90。正如预期的那样,这些AdC7疫苗中检测到少量的RBD结合IgG,与对照组相比没有显著差异(图4.E)。AdC7-S、AdC7-RBD或者AdC7-RBD-tr2免疫小鼠的BALF中均未检测到RBD结合IgA和中和抗体(图4.FG)。为了比较抗体的质量,针对这三种构建体计算了血清中和对结合的比率。结果表明AdC7-RBD-tr2引起最高的中和抗体对结合抗体比,表明其免疫聚焦优势可潜在降低ADE风险(图4.H和图5.A)。


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4. AdC7疫苗i.m.免疫BALB/c小鼠的体液免疫应答特征


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5. AdC7疫苗i.m.i.n.免疫BALB/c小鼠的体液免疫应答特征


由于通过肌肉注射(i.m.)接种每种AdC7疫苗的小鼠的BALF中检测到低水平的RBD结合抗体和中和抗体。研究者试图通过鼻内(i.n.)免疫小鼠来增强粘膜免疫。在第0天和第28天,通过i.n途径分别用1x 1011 vpAdC7接种小鼠。在第21天和42天采集血清进行抗体滴度检测(图1.B)。AdC7-S、AdC7-RBDAdC7-RBD-tr2均诱导产生大量的RBD结合IgGIgA(图6.I和图3.B)。AdC7-S、AdC7-RBDAdC7-RBD-tr2两剂免疫诱导的假病毒NT90滴度分别为210、207347(图6.J)。第42天采集小鼠BALF,均检测到高水平RBD结合的IgGIgAAdC7-RBD-tr2RBD结合IgGIgA的平均终点滴度分别为18001620,均高于其他两种疫苗(图6.KL)。RBD二聚体与单体构建体之间具有统计学意义。此外,对BALF进行假病毒NT90评估,假对照、AdC7-S、AdC7-RBDAdC7-RBD-tr2的平均NT90分别为10, 15, 17, 58(图6.M)。AdC7-RBD-tr2组粘膜假病毒NT90明显更高于AdC7-S组和AdC7-RBD组。此外,通过分析小鼠血清中的抗体质量,同样RBD-tr2疫苗表现出最高的中和抗体对结合抗体比(图6.N和图5.B)。综上所述,重组疫苗通过i.n.免疫可诱导全身和粘膜免疫。此外,AdC7-RBD-tr2还具有免疫聚焦的优势,可以诱导中和抗体阻断受体结合。


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6. AdC7疫苗i.n.免疫BALB/c小鼠的体液免疫应答特征


除体液免疫外,细胞免疫在预防SARS-CoV-2中也发挥着重要作用。为了表征AdC7疫苗诱导的细胞免疫应答,在第42天对同一组免疫的小鼠实施安乐死(图1.B)。收集脾脏淋巴细胞,用SARS-CoV-2 S蛋白的11肽重叠肽库刺激,采用酶联免疫斑点法(ELISpot)和细胞内细胞因子染色法(ICS)分析。IFN-γ ELISpot分析显示,小鼠通过i.m.i.n.接种了AdC7-S,AdC7-RBDAdC7-RBD-tr2疫苗能够诱导强烈的T细胞反应(图7.AB)。此外,流式细胞仪分析表明,所有这些重组AdC7疫苗能够强烈诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL),检测到IFNγIL-2产生。其中AdC7-RBD-tr2效果表现最好(图7.CE)。此外,这三种疫苗均中度诱导CD4+ T细胞反应细胞因子。相反,所有这三种疫苗都没有检测到大量的Th2细胞因子(IL-4IL-10)产生(图7.DF)。以上结果表明,通过i.n.i.m.两种途径接种AdC7-S、AdC7-RBDAdC7-RBD-tr2疫苗的小鼠均可诱导Th1偏向免疫应答。


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7. 细胞免疫反应的特征


鉴于AdC7-RBD-tr2疫苗能激发最强的RBD结合IgG、IgA、中和抗体和CTL,因此选择AdC7-RBD-tr2疫苗可进一步抵抗SARS-CoV-2攻击。由于小鼠ACE2S蛋白的低结合亲和力导致野生型BALB/c小鼠对SARS-CoV-2感染不敏感,研究者通过i.n.途径将表达人ACE2的重组Ad5 (Ad5-hace2)转导到BALB/c小鼠肺中,快速建立小鼠模型。5天后,接种疫苗小鼠受到TCID505x105剂量的SARS-CoV-2的攻击(图8.A)。通过i.n.途径接种AdC7-RBD-tr2可诱导小鼠产生大量的RBD结合IgG、IgA(图8.BC)和假病毒中和抗体(图8.D)。此外,活病毒中和试验显示,AdC7-RBD-tr2疫苗接种后的平均滴度分别为120(一剂)和154(两剂) (图8.E)。攻击3天后,取小鼠肺进行病毒滴定和病理分析。在一剂假对照组中,观察到高水平的病毒RNA,平均滴度为9.69log10 RNA拷贝数/克(图8.F)。而在接种AdC7-RBD-tr2的小鼠中观察到低水平的病毒RNA,平均滴度为5.48 log10 RNA拷贝数/克。在初免-加强免疫小鼠组中,对照组和AdC7-RBD-tr2每克小鼠肺中的病毒RNA (log10)平均滴度是9.335.28(图8.F)。由于肺中的部分病毒RNA可能来自输入的攻击病毒,因此还测量了亚基因组RNA(sgRNA)的水平以定量活病毒。在病毒复制期间sgRNA在受感染的细胞中产生,但在病毒体中不存在。结果显示,在对照组中,一剂和两剂方案分别观察到高水平的sgRNA,平均滴度分别为8.728.77 log10 RNA拷贝/克。令人鼓舞的是,接种一剂或两剂AdC7-RBD-tr2疫苗小鼠的肺样本中均未检测到病毒sgRNA(图8.G),表明AdC7-RBD-tr2疫苗具有完全的保护作用。


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8. AdC7-RBD-tr2SARS-CoV-2的保护作用


为了进一步评估感染SARS-CoV-2对肺损伤的疫苗保护作用,进行了组织病理学分析。结果发现对照组小鼠表现出明显的肺泡壁增厚,血管充血,炎性细胞浸润等病毒性肺炎特征(图9. A、B、IJ),但是接种了AdC7-RBD-tr2小鼠肺组织病理损伤和炎症反应都显著降低(图9.C、D、KL)。更重要的是,用抗SARS-CoV-2 NP抗体染色的肺部免疫荧光分析显示,对照组的肺中存在该病毒(图9.E、F、MN),而不存在于AdC7-RBD-tr2组(图9. G、H、OP)。总之,这些结果证明AdC7-RBD-tr2疫苗能强烈引发小鼠抗SARS-CoV-2的免疫反应,并赋予抵抗SARS-CoV-2感染的几乎消除性免疫力。


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9. AdC7-RBD-tr2对肺部感染和病变的保护作用


非中和抗体或亚中和浓度的抗体与病毒抗原结合而不阻断或清除感染被认为是ADE的主要原因。迄今为止,所有报道的COVID-19腺病毒载体疫苗均设计表达全长S蛋白或修饰S蛋白。可以针对具有结合活性的S蛋白上的非中和表位引发特异性抗体。为了降低ADE的潜在风险,研究者构建了一个表达RBD-tr2蛋白的重组AdC7疫苗,并证明了它诱导了具有高抗体质量和Th1偏向T细胞反应。此外,粘膜免疫也可以通过鼻内免疫有效激活,其特征是在BALF中检测到的结合RBDIgA和中和抗体的量。与全长S结构相比,RBD-tr2抗原可诱导更少的非中和抗体并提高抗体质量。由AdC7-RBD-tr2疫苗引起的总体免疫力使小鼠具有针对COVID-19的完全保护,而没有感染增强或免疫病理恶化。总的来说,这些结果表明AdC7-RBD-tr2是一种有希望的候选疫苗,可用于预防COVID-19的临床前和临床试验。


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